《保健食品原料用菌種安全性檢驗與評價技術指導原則（2020年版）》

微生物產生對人和動物有毒作用的活性代謝產物的能力。

2.3 毒性，Toxicity

微生物及其代謝產物對機體可能造成的潛在傷害（不良反應）。

3 對擬評價微生物菌種需提交的基本資料要求

在進行致病性評價試驗前，菌種送檢單位需提供以下資料供評價單位審核。

3.1 基本信息

擬評價菌種名稱（包括學名、俗名、曾用名、拉丁名等）、來源及用途。

3.2 菌種分類學資料

提供由有菌種鑒定資質的機構出具的對擬評價菌種的規范、科學的分類學（屬、種名稱及株）資料。細菌的分類和命名應遵循原核生物分類學國際委員會（International Committee on Systematics of Prokaryotes）的規定，并符合原核生物國際命名法規（International Code ofNomenclature of Prokaryotes）要求。真菌的分類和命名應按國際藻類、真菌和植物命名法規（International Code of Nomenclature for algae, fungi, and plants）進行。

3.3 菌種鑒定資料

根據目前已有的知識，提供基于表型及基因測序技術鑒定到種水平的資料。作為保健食品的功效成分（活菌），還應提供鑒定到株水平的資料。

3.4 菌種生長環境條件資料

提供擬評價菌種生長最適培養基及培養條件（培養時間、培養溫度和濕度、光照等），以及菌種保藏及復壯方法等相關資料。

3.5 誘變菌種

經過誘變的菌種還需提供詳細的菌種誘變方法（包括使用的誘變劑、誘變條件及誘變試驗流程等）和不少于100代（傳代間隔不少于7天）的遺傳穩定性研究報告。

3.6 生產相關信息

包括但不限于擬評價菌種安全用于保健食品的生產記錄、工藝流程、企業標準等資料。

3.7 國內外安全性評價資料綜述

基于國內外文獻數據，提供擬評價菌種的國內外使用歷史和安全性評價資料，包括其致病性和產毒能力的報告、研究文獻或綜述等；若無擬評價菌種的上述資料，應提供在親緣關系上與其相近種屬的安全性評價資料。

3.8 其他國家批準資料

提供其他國家已批準擬評價菌種作為膳食補充劑、功能食品或普通食品生產使用的相關證明資料。

3.9 其他需要說明的信息。

4 評價方法

對已經提供以上資料的擬評價菌株，可以按照以下方法開展評價。

4.1 全基因組測序（Whole Genome Sequencing, WGS）

4.1.1 基因測序

對擬評價菌株進行全基因組測序，分別獲得其基因組完成圖和框架圖，測序報告應包括（但不限于）以下信息：

- DNA提取方法

- 測序方案及儀器設備

- 序列組裝方法

- 序列質量評價

- FASTA文件

- 與預期基因組大小相關的重疊群（Contigs）總長度

- 基因注釋流程

- 對真菌而言，還需提供從相關數據庫中獲得的全基因組注釋質量信息。

4.1.2 基因序列分析

將擬評價菌株的全基因組序列與已有的數據庫，包括但不限于毒力基因數據庫（VFDB）、毒力/致病島數據庫（PAIDB）、生物防御數據庫（MvirDB）等最新版本中存儲的序列進行比對，并分析擬評價菌株遺傳物質中與致病明確相關的已知毒力因子和毒素代謝相關基因的存在情況。應提供包括（但不限于）以下信息的分析報告：

- 毒力/致病性（或產毒）相關基因名稱、所在位置、與最新數據庫中已有毒力基因的匹配度等信息

- 編碼的蛋白及序列號

- 毒力/致病因子（毒素產生、侵襲和粘附因子等）

- 序列長度覆蓋度≥60%

- 輸入序列與數據庫中序列的匹配度（≥85%）和e值（<10-5）

- 數據庫中已有的菌株名稱

- 基因組圖譜

- 擬評價的真菌菌株還應根據文獻報道能夠產生的毒素類別，針對性檢索是否存在毒素合成關鍵基因及其基因簇。

4.2 動物致病性試驗

由具備菌種致病性檢驗和評價資質的機構，分別按照附錄A、附錄B和附錄C規定的試驗方案，對擬評價的保健食品用細菌、絲狀真菌、酵母菌株開展致病性檢驗，對結果做出評價并出具報告。

4.3 產毒試驗

對某些能夠產生毒素的微生物，應在多種基質和條件下（單品種固體、多品種固體復合、不同成分的液體組合等）進行產毒試驗，并按照國家標準檢測方法或國際組織/相關國家規定的標準檢測方法進行有毒活性代謝產物含量檢測。

5 結果判定

5.1 滿足以下所有條件者，可用于保健食品。

5.1.1 動物試驗顯示無致病性。

5.1.2 產毒試驗結果顯示，在受試的任何一種基質中均不產生有毒活性代謝產物。

5.1.3 根據現有知識，全基因組序列分析未發現存在已知的毒力/致病基因（或毒素合成關鍵基因及其基因簇）。

5.2 全基因組序列中發現含有已知毒力/致病基因（或毒素合成關鍵基因及其基因簇），但動物試驗顯示不具有致病性、或產毒試驗檢測到已知的有毒活性代謝產物但其水平較低，長期攝入對人體健康無影響，結合國內外使用歷史，可用于保健食品。

5.3 動物試驗顯示具有致病性，或產生高水平已知有毒代謝產物，長期攝入可能影響人體健康，不能用于保健食品。

附錄A

(規范性附錄)

保健食品原料用細菌致病性檢驗方法

1 范圍

本方法規定了保健食品原料用細菌的致病性檢驗方法。

本方法適用于保健食品原料用細菌的致病性檢驗。

2 設備和材料

除微生物實驗室常規滅菌和培養設備外，其他設備與材料如下：

2.1 恒溫培養箱：36℃±1℃。

2.2 離心機：離心力³3000 ´ g。

2.3 電子天平：感量0.1 g 和0.001 g。

2.4 比濁儀。

2.5 溫濕度計。

2.6 顯微鏡：10×～100×。

2.7 厭氧培養裝置：厭氧罐、厭氧箱。

2.8 無菌錐形瓶：容量100 mL、500 mL。

2.9 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。

2.10 無菌試管：16 mm×160 mm。

2.11 無菌培養皿：直徑90 mm。

2.12 無菌量筒：容量100 mL。

2.13 微量移液器及配套槍頭：量程為100 μL～1000 μL。

2.14 注射器：量程為100 μL～1000 μL。

2.15 小鼠灌胃針頭。

3 培養基和試劑

3.1 無菌生理鹽水：商品化的生理鹽水或8.5 g NaCl溶于1000 mL蒸餾水中，分裝后121℃高壓滅菌15 min，備用。

3.2LB肉湯培養基：商品化培養基按照產品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，備用。

3.3LB瓊脂平板：商品化培養基按照產品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備LB瓊脂平板，備用。

3.4 半胱氨酸鹽酸鹽儲備液：稱取500 mg半胱氨酸鹽酸鹽于50 mL無菌離心管中，加入10 mL蒸餾水，充分溶解后用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后備用。

3.5 含有半胱氨酸鹽酸鹽的MRS肉湯培養基：商品化MRS肉湯培養基按照產品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，待培養基冷卻至50℃左右時，加入按3.4制備的半胱氨酸鹽酸鹽儲備液，使培養基中半胱氨酸鹽酸鹽的終濃度為500μg/mL，備用。

3.6 含有半胱氨酸鹽酸鹽MRS瓊脂平板：商品化MRS瓊脂培養基按照產品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，待培養基冷卻至50℃左右時，加入按3.4制備的半胱氨酸鹽酸鹽儲備液，使培養基中半胱氨酸鹽酸鹽的終濃度為500 μg/mL，用于制備含有半胱氨酸鹽酸鹽的MRS瓊脂平板。

3.7 含有半胱氨酸鹽酸鹽的雙歧桿菌瓊脂平板：商品化雙歧桿菌瓊脂培養基按照產品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，待培養基冷卻至50℃左右時，加入3.4中制備的半胱氨酸鹽酸鹽儲備液，使半胱氨酸鹽酸鹽的終濃度為500 μg/mL，用于制備含有半胱氨酸鹽酸鹽的雙歧桿菌瓊脂平板。

4 實驗動物

選用SPF級昆明或ICR健康成年小鼠，雌雄各半，體重范圍為18.0 g～22.0 g。

5 操作步驟

所有擬評價的菌株必須使用腹腔注射和經口灌胃兩種途徑給予動物受試物，以評價不同受試物暴露途徑對動物的致病性。

5.1 腹腔注射

5.1.1 菌株活化

目前我國已批準的可用于保健食品的細菌主要是雙歧桿菌屬和乳桿菌屬，除這兩個屬以外的其他新申報菌種在以下描述中均使用“其他細菌”。

根據送檢菌株的保存狀態，將雙歧桿菌和乳桿菌首先接種含有半胱氨酸鹽酸鹽的MRS肉湯、其他細菌接種LB肉湯或適于該菌生長的最適液體培養基中，并置適宜的培養條件下（包括培養溫度、濕度，厭氧、需氧、微需氧等）培養一定時間（培養時間長短視不同菌種而異）。

5.1.2 菌懸液制備

將5.1.1中活化的雙歧桿菌接種含有半胱氨酸鹽酸鹽的MRS瓊脂平板或含有半胱氨酸鹽酸鹽的雙歧桿菌瓊脂平板（乳桿菌接種含有半胱氨酸鹽酸鹽的MRS瓊脂平板，其他細菌接種LB瓊脂平板或適應于該菌生長的最適培養基瓊脂平板），在規定的適宜培養條件下（包括培養溫度、濕度，厭氧、需氧、微需氧等）培養一定時間（培養時間長短視不同菌種而異）后，刮取平板上的菌落，將其懸浮于無菌生理鹽水中，充分混勻后，用適量無菌生理鹽水調整菌懸液濃度并比濁，使最終菌懸液中的菌濃度達到5.0×107 CFU/mL，用于小鼠腹腔注射。

5.1.3注射

小鼠不少于40只，雌雄各半，隨機分成4組（每組不少于10只），包括雄性小鼠無菌生理鹽水對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠無菌生理鹽水對照組、雌性小鼠菌懸液組。每只小鼠注射0.2 mL，即受試物組每只小鼠注射菌量不少于1.0×107 CFU。

5.1.4觀察

動物腹腔注射后每天觀察1次，至少連續觀察21 d。

觀察并記錄小鼠皮膚和毛、眼睛和粘膜、呼吸情況、肢體活動、行為方式等有無異常。特別注意觀察是否出現振顫、抽搐、腹瀉、嗜睡、流涎和昏迷等現象。試驗前稱量并記錄所有小鼠的體重，試驗結束后稱量并記錄所有存活小鼠的體重。對于試驗期間死亡的小鼠，盡可能精確記錄小鼠的死亡時間，同時稱重并記錄。

5.2 經口灌胃

5.2.1 菌數預估

無菌吸取上述5.1.1的培養液，分別加至兩個無菌離心管中，每管1 mL，3000 ´g 離心10 min，棄去上清液后，用適量無菌生理鹽水調整菌懸液濃度并比濁，使最終菌懸液中菌的濃度分別不低于2.5×108 CFU/mL和1.25×109 CFU/mL，并分別記錄每mL培養液離心后所得沉淀物中細菌數調整至2.5×108 CFU/mL和1.25×109 CFU/mL時需加入的無菌生理鹽水的體積（mL）。

5.2.2 菌懸液制備

5.2.2.1 培養上清液的制備

根據受試動物總數和每只動物的灌胃體積計算所需要的受試菌株培養液用量。吸取5.1.1培養液，將培養液一分為二，3000 ´ g 各離心10min后，將上清液分別轉至100mL無菌量筒中，一份上清液用于菌懸液原液的制備，另一份上清液冷凍濃縮至原體積的五分之一，作為5倍濃縮上清液，備用。

5.2.2.2 菌懸液原液的制備

按照5.2.1中獲得的細菌終濃度達到2.5×108 CFU/mL所需要的生理鹽水體積，根據離心的培養物體積，按相同比例加入5.2.2.1獲得的上清液，調整離心后的沉淀物使其細菌數達到2.5×108 CFU/mL（上清液量不夠時可用空白培養基補齊）。

5.2.2.3濃縮菌懸液的制備

按照5.2.1中獲得的細菌終濃度達到1.25×109 CFU/mL所需要的生理鹽水體積，根據離心的培養物體積，按相同比例加入5.2.2.1獲得的5倍濃縮上清液，調整離心后的沉淀物使其細菌數達到1.25×109 CFU/mL。

5.2.3 灌胃

小鼠不少于80只，雌雄各半，分別隨機分成8組（每組不少于10只），包括雄性小鼠培養基對照組、雄性小鼠菌懸液組、雄性小鼠5倍濃縮培養基對照組、雄性小鼠5倍濃縮菌懸液組；雌性小鼠培養基對照組、雌性小鼠菌懸液組、雌性小鼠5倍濃縮培養基對照組、雌性小鼠5倍濃縮菌懸液組。各組均以20 mL/kg·BW的體積給小鼠灌胃，連續灌胃3 d，首次灌胃前小鼠應禁食過夜（16 h），灌胃后3 h～4 h喂食。

5.2.4 觀察

動物經口灌胃后每天觀察1次，至少連續觀察21 d，觀察指標同5.1.4。

6 結果與報告

對5.1和5.2的動物試驗結果進行統計學分析和綜合評價，包括：

（1）受試物對動物一般健康情況有無不良影響。

（2）受試物對動物體重等指標的影響。

（3）受試物組動物死亡情況。

（4）若受試物組動物在試驗期間未出現中毒癥狀或死亡，且體重等指標與對照組相比差異無統計學意義，即可判定該菌株無致病性；若受試物組動物在試驗期間出現中毒癥狀或死亡，或試驗期間體重等指標與對照組相比有顯著性差異，即可判定該菌株具有致病性。

附錄B

(規范性附錄)

保健食品原料用絲狀真菌的致病性檢驗方法

1 范圍

本方法規定了保健食品原料用絲狀真菌的致病性檢驗方法。

本方法適用于保健食品原料用絲狀真菌的致病性檢驗。

2 設備和材料

除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：

2.1 恒溫培養箱：28℃±1℃。

2.2 電子天平：感量為0.1 g。

2.3 錐形瓶：容量為500 mL。

2.4 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。

2.5 顯微鏡：10×～100×。

2.6 微量移液器及配套槍頭：量程為100 μL～1000 μL。

2.7 血球計數板。

2.8 注射器：量程為100 μL～1000 μL。

2.9 小鼠灌胃針頭。

2.10 溫濕度計。

2.11 接種鉤。

2.12 球磨儀或功能相當的儀器。

2.13 無菌培養皿：直徑90 mm。

3 培養基和試劑

3.1 麥芽汁瓊脂平板：商品化培養基按照產品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備麥芽汁瓊脂平板，備用。

3.2 馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板：商品化培養基按照產品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板，備用。

3.3 無菌生理鹽水：商品化的生理鹽水或8.5 g NaCl溶于1000 mL蒸餾水中，分裝后121℃高壓滅菌15 min，備用。

如擬評價菌株在上述兩種培養基上的生長狀態和產孢子量均不理想，可選用適于該菌株生長和產孢的其他培養基。

4 實驗動物

選用SPF級昆明或ICR健康小鼠，雌雄各半，體重范圍為18.0 g～22.0 g。

5 操作步驟

所有擬評價菌株必須使用腹腔注射和經口灌胃兩種途徑給予動物受試物，以評價不同受試物暴露途徑對動物的致病性。

5.1 腹腔注射

5.1.1 菌懸液制備

5.1.1.1 產孢子量大的菌株：將擬評價菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板（紅曲霉屬菌株接種麥芽汁瓊脂平板）或適于擬評價菌株生長的培養基平板，28℃±1℃培養7 d～14 d后，挑取平板上的孢子，將其懸浮于無菌生理鹽水中，充分混勻后，用血球計數板計數孢子濃度，并用適量無菌生理鹽水調整，使其最終濃度不低于5.0×107 CFU/mL。

5.1.1.2 產孢子量少或不產孢子的菌株：將擬評價菌株接種于適宜的培養基上， 28℃±1℃下培養7 d～14 d或在適宜的誘導產孢條件下培養一定時間后，挑取平板的菌絲體及孢子，用球磨儀（或其他功能相當的儀器）將菌絲體磨碎，經生理鹽水重懸后，用血球計數板計數，并用適量無菌生理鹽水調整，使菌懸液中菌絲體片段數/孢子的最終濃度不低于5.0×107 CFU/mL。

5.1.2 注射

小鼠不少于40只，雌雄各半，分別隨機分成4組（每組不少于10只），包括雄性小鼠生理鹽水對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠生理鹽水對照組、雌性小鼠菌懸液組，每只小鼠注射0.2 mL，即受試物組每只小鼠注射的菌量不少于1.0×107 CFU。

5.1.3觀察

動物腹腔注射后每天觀察1次，至少連續觀察21 d，觀察指標同附錄A中的5.1.4。

5.2 經口灌胃

5.2.1 菌懸液制備

除制備的菌懸液中真菌孢子/菌絲體片段的濃度不低于2.5×108 CFU/mL外，其他操作步驟同5.1.1。

5.2.2 灌胃

小鼠不少于40只，雌雄各半，分別隨機分成4組（每組不少于10只），包括雄性小鼠生理鹽水對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠生理鹽水對照組、雌性小鼠菌懸液組，各組均以20 mL/kg·BW的體積給小鼠灌胃1次，灌胃前禁食過夜（16 h），灌胃后3 h～4 h喂食。

5.2.3 觀察

動物經口灌胃后每天觀察1次，至少連續觀察21 d，觀察指標同附錄A中的5.1.4。

6 結果與報告

對5.1和5.2的動物試驗結果進行統計學分析和綜合評價，內容同附錄A中的條款6。

附錄C

(規范性附錄)

保健食品原料用酵母的致病性檢驗方法

1 范圍

本方法規定了保健食品原料用酵母的致病性檢驗方法。

本方法適用于保健食品原料用酵母的致病性檢驗。

2 設備和材料

除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：

2.1 恒溫培養箱：28℃±1℃。

2.2 電子天平：感量為0.1 g。

2.3 錐形瓶：容量為500 mL。

2.4 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。

2.5 顯微鏡：10×～100×。

2.6 微量移液器及配套槍頭：量程為100 μL～1000 μL。

2.7 血球計數板。

2.8 注射器：量程為100 μL～1000 μL。

2.9 小鼠灌胃針頭。

2.10 溫濕度計。

2.11 接種環。

2.12 離心機：離心力³3000 ´ g。

2.13 無菌培養皿：直徑90 mm。

2.14 無菌量筒：容量100 mL。

3 培養基和試劑

3.1 麥芽汁瓊脂平板：商品化培養基按照產品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備麥芽汁瓊脂平板，備用。

3.2 麥芽汁培養基：商品化培養基按照產品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備麥芽汁培養基，備用。

3.3 無菌生理鹽水：商品化的生理鹽水或8.5 g NaCl溶于1000 mL蒸餾水中，分裝后121℃高壓滅菌15 min，備用。

如擬評價菌株在麥芽汁培養基上的生長狀態不理想，可選用適于該菌株生長的其他培養基。

4 實驗動物

選用SPF級昆明或ICR健康小鼠，雌雄各半，體重范圍為18.0 g～22.0 g。

5 操作步驟

所有擬評價菌株必須使用腹腔注射和經口灌胃兩種途徑給予動物受試物，以評價不同受試物暴露途徑對動物的致病性。

5.1 腹腔注射

5.1.1 菌懸液制備

將擬評價菌株接種麥芽汁瓊脂平板，28℃±1℃培養一定時間（培養時間長短視不同菌種而異）后，刮取平板上的菌落，將其懸浮于無菌生理鹽水中，充分混勻后用血球計數板計數，并用適量無菌生理鹽水調整菌懸液濃度，使菌懸液中菌的最終濃度不低于5.0×107 CFU/mL。

5.1.2注射

小鼠不少于40只，雌雄各半，分別隨機分成4組（每組不少于10只），包括雄性小鼠生理鹽水對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠生理鹽水對照組及雌性小鼠菌懸液組，每只小鼠注射0.2 mL，即受試物組每只小鼠注射的菌量不少于1.0×107 CFU。

5.1.3觀察

動物腹腔注射后每天觀察1次，至少連續觀察21 d，觀察指標同附錄A中的5.1.4。

5.2 經口灌胃

5.2.1 菌株培養

將菌株接種到麥芽汁培養基上，28℃±1℃培養一定時間（培養時間長短視不同菌種而異）后，備用。

5.2.2 菌數預估

無菌吸取上述5.2.1的培養液，分別加至兩個無菌離心管中，每管1 mL，3000 ´ g 離心10 min，棄去上清液后，用適量無菌生理鹽水調整菌懸液濃度并計數，使最終菌懸液中菌的濃度分別不低于2.5×108 CFU/mL和6.25×108 CFU/mL，并分別記錄每mL培養液離心后所得沉淀物中酵母菌數調整至2.5×108 CFU/mL和6.25×108 CFU/mL時加入無菌生理鹽水的體積（mL）。

5.2.3 菌懸液制備

5.2.3.1 培養上清液的制備

根據受試動物總數和每只動物的灌胃體積計算所需要的受試菌株培養液用量，繼而將培養液一分為二，3000 ´ g 各離心10 min后，將上清液分別轉至100 mL無菌量筒中，一份上清液作為菌懸液原液的制備，另一份上清液冷凍濃縮至原體積的五分之二，作為2.5倍濃縮上清液，備用。

5.2.3.2 菌懸液原液的制備

按照5.2.2中獲得的酵母終濃度達到2.5×108 CFU/mL所需要的生理鹽水體積，根據離心的培養物體積，按相同比例加入5.2.3.1獲得的上清液，調整離心后的沉淀物使其酵母數達到2.5×108 CFU/mL（上清液量不夠時可用空白培養基補齊）。

5.2.3.3 濃縮菌懸液的制備

按照5.2.2中獲得的酵母菌終濃度達到6.25×108 CFU/mL所需要的生理鹽水體積，根據離心的培養物體積，按相同比例加入5.2.3.1獲得的培養上清液2.5倍濃縮液，調整離心后的沉淀物使其菌數達到6.25×108 CFU/mL。

5.2.4 灌胃

小鼠不少于80只，雌雄各半，分別隨機分成8組（每組不少于10只），包括雄性小鼠培養基對照組、雄性小鼠菌懸液組、雄性小鼠2.5倍濃縮培養基對照組、雄性小鼠2.5倍菌懸液組；雌性小鼠培養基對照組、雌性小鼠菌懸液組、雌性小鼠2.5倍濃縮培養基對照組及雌性小鼠2.5倍菌懸液組。各組均以20 mL/kg·BW的體積給小鼠灌胃1次，灌胃前應禁食過夜（16 h），灌胃后3 h～4 h喂食。

5.2.5 觀察

動物經口灌胃后每天觀察1次，至少連續觀察21 d，觀察指標同附錄A中的5.1.4。

6 結果與報告

對5.1和5.2的動物試驗結果進行統計學分析和綜合評價，內容同附錄A中的條款6。